人诱导多能干细胞（hiPSCs）向破骨细胞的分化

破骨细胞的骨吸收功能缺陷可导致多种罕见遗传性骨病以及骨质疏松症、骨硬化症等部分常见疾病。利用人诱导多能干细胞hiPSC分化获得的破骨细胞为该研究领域开辟了新路径 —— 它能提供无限的细胞来源并克服人体样本获取困难、缺乏合适动物模型等难题。人诱导多能干细胞的建系技术已较为成熟但将其高效分化为破骨细胞仍具有挑战性。已发表的 hiPSC - 破骨细胞分化方案多采用 hiPSC-OP9 共培养体系或基于 hiPSC 来源的拟胚体EB联合多种细胞因子诱导。这里介绍一种三阶段分化方案与其他方法相比本方案无需共培养体系可均一诱导拟胚体向中胚层分化分化所需细胞因子更少破骨细胞成熟时间更短且能获得足够数量的破骨细胞用于后续分子生物学分析。图 iPSC诱导为破骨细胞流程图源自Chen, I. (2020). Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) into Osteoclasts.Bio-protocol10(24): e3854. DOI:10.21769/BioProtoc.3854.第一阶段hiPSCs来源胚状体EBs的中胚层分化培养时长4天核心目的将hiPSCs解离为单细胞并形成均一大小EBs诱导其向中胚层定向分化为后续髓单核细胞生成奠定基础。筛选未分化的hiPSCs用Accutase酶解离为单细胞经PBS洗涤、340×g 4℃离心7分钟后用含Stempro-34基础培养基、L-谷氨酰胺、MTG、hBMP4、hVEGF、Rock抑制剂Y-27632、抗坏血酸的EB中胚层分化培养基-1重悬过70μm细胞筛并计数以每孔15000个细胞接种于Nunclon Sphera 96孔板37℃、5%CO₂5%O₂培养2天每孔形成单个均一EBs培养第3天进行半量换液弃75μl旧培养基加入等体积含Stempro-34基础培养基、L-谷氨酰胺、MTG、2倍浓度hBMP4和hVEGF以及hTPO、hFLT3-配体、hSCF、碱性hFGF、抗坏血酸的EB中胚层分化培养基-2继续相同条件培养2天培养1-4天期间通过qPCR检测CDX2、CD34、Brachyury等中胚层标记基因的表达水平验证中胚层分化效果。第二阶段髓单核细胞群的扩增培养时长21天核心目的将中胚层EBs诱导扩增为破骨细胞前体细胞髓单核细胞该细胞群高表达CD14、CD43、CD45表面标志物。收集第一阶段的EBs至离心管重力沉降3-5分钟后弃上清用含Advanced DMEM培养基、10%FBS、L-谷氨酰胺、NEAA、β-巯基乙醇、25 ng/ml hIL-3、50ng/ml hM-CSF的髓单核细胞扩增培养基重悬按每孔40-50个EBs接种于明胶包被的6孔板37℃、5%CO₂5%O₂培养培养第4天首次换液更换为含100ng/ml hM-CSF的同配方髓单核细胞扩增培养基后续每4天换液一次第8、12、16天维持相同培养条件分别在培养第10、13、17、21天收集体系中的悬浮细胞用含PBS、2%FBS、2mM EDTA的FACS缓冲液配制CD14、CD43、CD45抗体工作液对细胞进行染色后流式检测第17天为前体细胞最佳收集时间标志物表达量最高且稳定性好收集该时间点的悬浮髓单核细胞即为破骨细胞前体细胞备用。第三阶段破骨细胞的成熟诱导培养时长7-14天核心目的将髓单核前体细胞诱导为具备骨吸收功能的成熟多核破骨细胞从形态、染色、基因、功能多维度验证分化效果。收集第二阶段第17天的悬浮前体细胞4℃、340×g离心7分钟计数后按每孔10000个细胞的密度同时接种于96孔板和铺有骨片的培养体系中加入含α-MEM培养基、10%FBS、1α,25-二羟维生素D3、5 ng/ml hTGFβ-1、30 ng/ml hM-CSF、50 ng/ml hRANKL的破骨细胞分化培养基37℃、5%CO₂培养每2-3天更换一次新鲜的分化培养基培养7-10天倒置显微镜下观察细胞形态可见多核成熟破骨细胞形成完成形态学初步鉴定培养10-12天吸弃培养基用PBS轻洗每孔加150μl 2.5%戊二醛室温固定10分钟配制含蒸馏水、固红GBC、硝酸钠、萘酚AS-BI磷酸溶液、乙酸溶液、酒石酸溶液的TRAP染色液每孔加100μl染色液37℃孵育45分钟~1小时弃液用蒸馏水冲洗晾干显微镜下观察紫红色大体积多核细胞为TRAP阳性成熟破骨细胞培养14天对骨片上的TRAP染色阳性细胞进行固定通过扫描电镜观察骨片上的骨吸收陷窝验证成熟破骨细胞的骨吸收功能通过 qPCR 检测破骨细胞标志基因如hTRAP、hNFATc1、hCTSK、hCALCITONIN R的表达水平以确认破骨细胞的分化状态。产品推荐产品编号产品名称规格CM065-5HPBMP-4HumanAnimal-Free5 μgCM065-20HP20 μgCM065-100HP100 μgCM065-500HP500 μgCM065-1000HP1 mgCM058-5HPVEGF165HumanAnimal-Free5 μgCM058-20HP20 μgCM058-100HP100 μgCM058-500HP500 μgCM058-1000HP1 mgCM124-5HPTPOHumanAnimal-Free5 μgCM124-20HP20 μgCM124-100HP100 μgCM124-500HP500 μgCM086-5HPFlt-3 LigandHumanAnimal-Free5 μgCM086-20HP20 μgCM086-100HP100 μgCM086-500HP500 μgCM086-1000HP1 mgCM091-20HPFGF-2 bFGF/FGF-BasicHumanAnimal-FreeTag free20 μgCM091-100HP100 μgCM091-500HP500 μgCM091-1000HP1 mgCM171-5HPSCFHumanAnimal-Free5 μgCM171-20HP20 μgCM171-100HP100 μgCM171-500HP500 μgCM171-1000HP1 mgCM005-5HPIL-3HumanAnimal-Free5 μgCM005-20HP20 μgCM005-100HP100 μgCM005-500HP500 μgCM005-1000HP1 mgCM116-5HPM-CSFHumanAnimal-Free5 μgCM116-20HP20 μgCM116-100HP100 μgCM116-500HP500 μgCM116-1000HP1 mgCM059-5HPRANKLHumanAnimal-Free5 μgCM059-20HP20 μgCM059-100HP100 μgCM059-500HP500 μgCM059-1000HP1 mgCM088-5HPTGF beta 1HumanAnimal-Free5 μgCM088-20HP20 μgCM088-100HP100 μgCM088-500HP500 μgCM088-1000HP1 mg